KHẢO SÁT KHẢ NĂNG BẮT GỐC TỰ DO ABTS﮲⁺

ĐÔI LỜI NHẮN NHỦ

Các kiến thức mình trình bày đều dựa trên cơ sở khoa học (có trích dẫn) và kinh nghiệm cá nhân của mình khi làm thí nghiệm, mình cố gắng trình bày rõ ràng nhất có thể và mong các bạn tiếp thu một cách linh hoạt và có chọn lọc, tránh tình trạng rập khuôn.

Ngoại trừ phần "Nguyên tắc" mình sẽ viết theo văn phong khoa học, hầu hết các phần còn lại mình sẽ viết theo văn phong nói thông thường vì mong muốn truyền đạt thông tin đến các bạn một cách chi tiết và dễ hiểu nhất.




NGUYÊN TẮC

Phương pháp đánh giá sự kháng oxi hóa dựa vào khả năng bắt gốc ABTS﮲⁺ (2,2 – azinobis – 3 ethyl benzothiazoline – 6 – sulfonic acid) [1]. Có cùng cơ chế hoạt động với phướng pháp bắt gốc DPPH, tuy nhiên ABTS bản chất không phải gốc tự do, đòi hỏi sự chuyển đổi bằng một tác nhân oxi hóa mạnh là KS₂O. Khi bị oxi hóa, ABTS mất một điện tử và tạo ra gốc tự do ABTS﮲⁺. Chính điện tử độc thân trên gốc tự do đã hình thành nên hệ liên hợp điện tử và làm cho ABTS chuyển màu xanh, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 734 nm. Nếu bị khử bởi chất có hoạt tính kháng oxy hóa, ABTS﮲⁺ sẽ chuyển về dạng ban đầu ABTS không màu. Khả năng khử ABTS﮲⁺ của một chất kháng oxy hóa thể hiện ở mức độ làm giảm màu của dung dịch ABTS, xác định được bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại 734 nm.

PHA HÓA CHẤT

1.     Pha dung dịch ABTS 

  • ABTS 7 mM (M = 548.7): 3.8409 x 10⁻³ (g) + 1 mL H₂O
  • KS₂O₈ 2.45 mM (M = 270.32): 0.662284 x 10⁻³ (g) + 1 mL H₂O
  • Trộn 2 dung dịch vừa pha theo tỷ lệ 1:1 được dung dịch ABTS gốc (stock), để yên trong tối ở t°p từ 12-24h
  • Tính toán thể tích dung dịch ABTS cần cho phản ứng, lấy falcon/becher/erlen thêm một lượng dung môi pha mẫu bằng với thể tích ABTS cần pha, sau đó cho từ từ stock vào cho đến khi giá trị OD₇₃₄ₙₘ = 0.7 ± 0.02

*** ABTS và KS₂O₈ phản ứng theo tỉ lệ 1 : 0.5, và KS₂O₈ là một chất oxy hóa mạnh dùng để chuyển đổi ABTS thành ABTS﮲⁺, do đó phải đảm bảo phản ứng theo tỷ lệ sao cho KS₂O phản ứng hoàn toàn (không dư), vì nếu dư KS₂O, mẫu cần phân tích sẽ ưu tiên phản ứng với KS₂O thay vì ABTS﮲⁺


2.     Pha mẫu cần phân tích

Đối với mẫu dạng rắn (cao chiết/ bột):

-        Xác định dung môi để hòa tan mẫu. Lấy một ít mẫu, hòa trong các dung môi khác nhau (nước, methanol, ethanol, acetone, DMSO,… ). Quan sát lựa chọn dung môi nào có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu cần phân tích. Nếu đã biết mẫu của mình hòa tan trong chất nào rồi, các bạn có thể bỏ qua bước này.

-        Hòa tan 1000 ug mẫu vào 1 mL dung môi, thu được dung dịch có nồng độ 1000 ppm.

-        Pha loãng bậc 2 liên tiếp (two-fold serial dilution) thành dãy các nồng độ khác nhau và dừng ở khoảng nồng độ từ 5 – 10 ppm.

 

Đối với mẫu phân tích dạng lỏng (dịch chiết):

-        Định lượng chất cần phân tích trong dịch chiết và tùy theo chất của các bạn là loại hợp chất gì, sẽ có những phương pháp định lượng khác nhau. Ví dụ, bạn có dịch chiết từ bắp cải tím và muốn phân tích hoạt tính của hợp chất anthocyanin trong dịch chiết, bạn sử dụng phương pháp “pH Vi Sai” để xác định dịch chiết ban đầu có hàm lượng anthocyanin là bao nhiêu ppm.

-        Từ dịch chiết ban đầu, pha loãng bậc 2 liên tiếp (two-fold serial dilution) thành dãy các dịch chiết ở độ pha loãng khác nhau (nên làm từ 7 – 10 lần pha loãng). Ở bước này, sử dụng dung môi tách chiết mẫu để pha loãng mẫu.

-        Từ hàm lượng chất có trong dịch chiết ban đầu, xác định hàm lượng chất cần phân tích trong dịch chiết ở mỗi bậc pha loãng.


3.      Pha đối chứng

 

Nếu sử dụng đối chứng dương là vitamin C, pha dãy nồng độ từ 0  30 ppm, sử dụng dung môi là nước (Vitamin C tan tốt trong nước)

Nếu sử dụng các đối chứng khác, cân 100 ug chất đối chứng và hòa tan trong 1mL dung môi (nồng độ 100 ppm), sau đó pha loãng bậc 2 về khoảng nồng độ 0 – 5 ppm và thử hoạt tính của cả dãy nồng độ từ 0 ppm đến 100 ppm. 

TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG

Thí nghiệm được tiến hành dựa theo mô tả của Roberta và cộng sự (1998) [1].

  • Dung dịch ABTS﮲⁺ được tạo thành bằng cách trộn dung dịch KS₂O 2,45mM với dung dịch ABTS 7mM theo tỉ lệ 1:1. Để dung dịch ổn định trong 6-12 giờ.
  • Pha loãng dung dịch ABTS bằng ethanol cho đến khi đạt độ hấp thu 0,7 ± 0,02 ở 734nm. 
  • Cho 10μl dung dịch cao chiết vào 1ml dung dịch ABTS﮲⁺, vortex kỹ.
  • Sau 1 phút, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 734nm.

Bảng bố trí thí nghiệm

 

Mẫu phân tích

Mẫu trắng

Mẫu đối chứng dương

Mẫu đối chứng âm

Dung dịch ABTS

x

 

x

x

Mẫu phân tích

x

x

 

 

Chứng dương (Vitamin C)

 

 

x

 

Ethanol

 

x

 

 

Dung môi pha mẫu

 

 

 

x


CÔNG TH
ỨC TÍNH

Phần trăm gốc tự do ABTS﮲⁺ được tính theo công thức:


Chú thích

SCABTS  : Khả năng bắt gốc tự do ABTS﮲⁺ (%)
As           : Độ hấp thu quang của mẫu phân tích
Ab           : Độ hấp thu quang của mẫu trắng
An           : Độ hấp thu của mẫu đối chứng âm

Tính giá trị IC50 của mẫu thử và mẫu đối chứng dựa vào phương trình tuyến tính giữa nồng độ (trục x) và % bắt gốc tự do của chúng (trục y) (phương trình có dạng y = ax + b), theo công thức sau:


Chú thích

IC50    : Nồng độ mẫu thử, chuẩn có thể bắt được 50% gốc tự do ABTS﮲⁺
a, b     : Lần lượt là độ dốc và hệ chắn của phương trình tuyến tính giữ nồng độ và % bắt gốc tự do.

Mẫu được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ±SD

LƯU Ý

Có thể pha tùy ý nồng độ ABTS﮲⁺, chỉ cần đảm bảo gốc ABTS﮲⁺ trong phản ứng luôn dư. Mặc dù vậy, mình không khuyến khích các bạn pha dung dịch ABTS ở nồng độ quá cao, vì lúc này màu của dung dịch ABTS rất đậm, có thể khó quan sát sự thay đổi của màu sắc trước và sau phản ứng trong một số trường hợp.

Dung dịch ABTS nhạy cảm với ánh sáng, dễ bị oxy hóa, vì vậy các bạn không nên pha quá nhiều, nếu pha dư có thể bảo quản ở nhiệt độ lạnh và bọc kín giấy bạc để tránh ánh sáng, và sử dụng sau 1-2 ngày, không nên dùng khi đã để quá lâu hoặc quan sát thấy màu sắc nhạt đi so với ban đầu.

Mẫu đối chứng âm là mẫu quan trọng, các bạn nên lặp lại nhiều lần mẫu này trong một mẻ thí nghiệm (trên 3 lần) để có thể có số liệu chính xác nhất.

Mẫu trắng cần thiết trong trường hợp chất phân tích của bạn có màu, đặc biệt là những chất có màu sắc gần giống với màu của dung dịch ABTS (dung dịch chứa cao chiết các loại lá cây,...). Đối với trường hợp mẫu không màu và trong suốt, các bạn có thể bỏ qua mẫu trắng.

Mẫu phân tích cần được hòa tan hoàn toàn, nếu là dịch chiết thì dịch chiết cần đồng nhất và không có cặn bẩn. Nếu cần thiết, các bạn có thể sử dụng filter 0.45 um để lọc mẫu trước khi phân tích.

Khi thêm các thành phần phản ứng eppendorf hoặc ống nghiệm, dung dịch ABTS cần được thêm sau cùng, và đảm bảo tránh ánh sáng nhiều nhất có thể. Các bạn có thể bọc eppendorf hoặc ống nghiệm lại bằng giấy bạc. để phản ứng diễn ra ở nơi không có ánh sáng. Sau thời gian phản ứng, kết quả cần được đo ngay, không để lâu ngoài ánh sáng.

Phần kết quả, các bạn có thể nhập vào excel và tính toán thủ công theo công thức mình đã trình bày, hoặc có thể sử dụng một số phần mềm thông dụng để có được kết quả nhanh hơn nhé. Ở đây, mình đề xuất một phần mềm quen thuộc là Graphpad Prism. 

THAM KHẢO


Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free radical biology and medicine. 1999;26(9-10):1231-1237.

 Lê Phương Uyên.

Latest