Slide 2
NỘI DUNG
• 1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH
• 2. GIỚI THIỆU -OMICs
• 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -OMICs
• 4. ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC
Slide 3
Trước khi phương pháp omics ra đời, các nhà khoa học đã tìm ra rất nhiều phương pháp phát hiện bệnh ở người, xong những phương pháp đều dựa vào kiểu hình của bệnh, mất rất nhiều thời gian, phức tạp, điều trị ở cấp độ tế bào, cá thể, quần thể, khó khăn trong việc thử thuốc và điều trị trực tiếp để phát hiện những hạn chán của thuốc. Các phương pháp như :
- Nghiên cứu phả hệ.
- Nghiên cứu trẻ đồng sinh.
- Nghiên cứu di truyền tế bào.
- Nghiên cứu thống kê quần thể.
Slide 4
Từ những hạn chế trên đã thôi thúc phương pháp –omics ra đời.
Omics dùng để chỉ một lĩnh vực khoa học nghiên cứu trong sinh học. Phổ biến gồm
1. Genomics: Là khoa học nghiên cứu toàn bộ các gen của genome trong cơ thể phát hiện đột biến xảy ra trên bộ gen
- Ba lĩnh vực chính của genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức năng (functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics). Genomics được xem là tâm điểm của sinh học, bởi mọi kết quả từ nghiên cứu genomics đã, và đang đóng góp tích cực vào các lĩnh vực ứng dụng như chăm sóc sức khỏe con người, nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác. Sự phát triển nhanh chóng của genomics có sự trợ giúp của các ngành khoa học kỹ thuật khác
2. Transcriptomics: Những nghiên cứu ở mức độ phiên mã gen. phát hiện ra thay đổi biểu hiện gen ở mức phiên mã có liên quan đế bệnh
3. Proteomics: Là bộ môn khoa học nghiên cứu về proteome phát hiện ra những thay đổi trong biểu hiện gen ở mức dịch mã có liên quan đến bệnh
Slide 5
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Slide 6
Các phương pháp phổ biến để phát hiện bệnh trong proteomics gồm: Phát hiện protein với kháng thể, Phát hiện protein không dùng kháng thể, protein chips, Reverse-phased protein microarrays, điện di 2 chiều.
Slide 7
1. Khái niệm về ELISA
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
(Trích từ Chemicon International)
2. Phân loại ELISA
2.3. Sandwich ELISA
Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich).
DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào. Những kháng nguyên được pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn.
Kháng thể bắt sau đó được thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh hoạt của phương pháp, ví dụ như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên.
Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thước và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm.
2.4. Phản ứng ức chế /cạnh tranh
Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba. Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.
Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ trước phản ứng đó được gọi là ức chế (blocking/ inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể được thêm vàođồng thời với nhau (hình 1).
Hình 1 : sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh
1. WESTERN BLOT
1. Nguyên lý
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (Kháng nguyên – Kháng thể). Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang
2. Các bước thực hiện:
Bước 1: Xử lý mẫu
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp các yếu tố trên.
Phương pháp điện di phổ biến nhất là điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung sodium dodecyl sulfate (SDS). Phương pháp SDS – PAGE (điện di trên gel polyacrylamide và có bổ sung SDS) giữ các polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng được xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc 3.
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Để các protein có thể phát hiện được kháng thể thì protein phải được chuyển từ gel lên màng lai. Phương pháp chính để chuyển các protein được gọi là phương pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Kết quả là protein sẽ được phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định
Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu. Việc ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột không béo trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa gắn vào. Do đó khi kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn chỗ bám trên màng ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này làm giảm nhiễu cơ bản trong sản phẩm cuối cùng của Western Blot, cho kết quả rõ ràng và ngoại trừ hiện tượng dương tính giả.
Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai
Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme này khi kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bước:
- Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu được tao ra khi cho vật chủ hay môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm.
- Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme (thường sử dụng horseradish peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt 1 tấm phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.
Slide 8
Sắc ký đảo pha
2. Phân tích khối phổ MALDI - TOF để xác định khối lượng của các peptide của mỗi protein. Các thông số hoạt động của máy khối phổ gồm:
- Nguồn laser: 40
- Profile: 100 profile cho một lần bắn
- Cổng ion: tắt
- Khối lượng tối ưu: 2000Da
- Phổ khối lượng: 500 – 5000Da
Mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ liệu về khối lượng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi enzyme trypsin. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại đầu C của lysine và arginine. Thông thường, một protein 10 kDa sẽ bị trypsin phân cắt thành 30 đoạn peptide có khối lượng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc điểm thuận lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh ngay cả trong dung dịch lẫn khi thủy phân trong gel.
Slide 9
3. ĐIỆN DI 2 CHIỀU
Cho đến nay, điện di hai chiều (2-DE) vẫn là kỹ thuật được dùng phổ biến nhất để phân tách các protein trong một mẫu phức tạp. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0.1 đơn vị pI và 1 kDa về khối lượng phân tử.
Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau.
Chiều 1: Điện di đẳng điện, sợi IPG strip pH 4-7 dài 17cm; Chiều 2: Điện di SDS-PAGE, gel polyacrylamide 10% có SDS
Đầu tiên bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản ). Sau đó hình ảnh bản gel được phân tích bằng phần mềm này. Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ tự cho các spot. Dựa vào cường độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel (được tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100), vị trí và thể tích của spot được xác định và có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng.
Slide 10
LCM
Một phương pháp được sử dụng để giảm thiểu thiệt hại tế bào và nắm bắt được mô hình protein chính xác trong ung thư và các tế bào bình thường là LCM. Các nhà nghiên cứu sử dụng tia laze năng lượng thấp và bộ phim truyền đặc biệt để nâng một tế bào mong muốn ra khỏi phần mô, để lại tất cả các tế bào không mong muốn. Sau đó họ có thể thu thập tất cả các protein có mặt trong các tế bào đã chọn, lập bản đồ mô hình protein và lưu trữ thông tin trong cơ sở dữ liệu máy tính.
Laser lấy vi mẫu (LCM) cung cấp một số lợi thế cho nghiên cứu protein. Ví dụ, với kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu có thể chụp các bộ tế bào riêng biệt từ các mô bình thường, ung thư, ung thư và thậm chí cả mô sẹo, tất cả đều từ mẫu sinh thiết của bệnh nhân đó.
Microarray
Nguyên lý hoạt động mấu chốt của microarray là sự lai giữa hai chuỗi ADN, đặc tính của trình tự acid nucleic là bắt cặp bổ sung một cách đặc hiệu với chuỗi còn lại do hình thành liên kết hydro giữa các cặp bazơ nitơ bổ sung. Sau khi rửa các trình tự gắn không đặc hiệu, chỉ có những chuỗi bắt cặp mạnh mẽ sẽ được giữ lại. Các trình tự đích được đánh dấu huỳnh quang gắn với đầu dò cho tín hiệu phụ thuộc vào điều kiện lai (ví dụ như nhiệt độ) và điều kiện rửa sau lai. Độ mạnh của tín hiệu tại một điểm phụ thuộc vào lượng mẫu đích gắn với đầu dò. Microarray sử dụng định lượng tương đối khi mà cường độ của một điểm đặc trưng được so sánh với điểm giống như vậy ở trong điều kiện khác nhau
SLIDE 11
Protein chip
Loại chip protein này có chứa mật độ protein cao, thường được lấy từ kháng thể. Các chip này hiện đang được thực hiện dựa trên các đăc tinhd, protein – DNA, protein-protein, protein-ligand. Chip sẽ chứa toàn bộ các đặc tính của pro trong 1 tế bào nhất định, gồm 1 kháng thể khác nhau được sáp xếp để phát hiện các kháng nguyên tương ứng của chúng từ mẫu( phổ biến từ mẫu máu). Chips pro đầu tiên bao gồm 5000 pro tinh khiets được tạo ra từ sinh khối nấm men trên kính hiển vi thủy tinh. Chip protein được tạo ra khó hơn DNA dó pro là phân tử động, ít ổn định và cấu trúc khó cố định trên mặt kính.
SLIDE 13
TRANSCRIPTOMICS
SAGE/CAGE
Trong sinh vật, gen được sao chép và ghép (ở sinh vật nhân chuẩn ) để sinh ra mRNA trưởng thành (màu đỏ). mRNA được từ cơ thể, và sao chép ngược lại được sử dụng để sao chép mRNA thành cDNA kép bền vững ( ds - cDNA , màu xanh). Trong SAGE, ds-cDNA được cắt bởi các enzyme cắt hạn chế (ở vị trí 'X' và 'X' + 11) để tạo ra các mảnh 'tag' 11-nucleotide. Các thẻ này được ghép nối và sắp xếp theo trình tự bằng cách sử dụng trình tự Sanger dài đọc (các màu xanh khác nhau chỉ ra các thẻ từ các gen khác nhau). Các trình tự được phân hủy để tìm sự lặp lại của mỗi trình từ. Sự lặp lại của các trình tự có thể được sử dụng để SO SÁNH về bản sao của gen quan tâm
DNA MICROARRAY
Trong sinh vật, gen được sao chép và ghép nối (ở sinh vật nhân chuẩn) để sinh ra mRNA trưởng thành (màu đỏ). mRNA từ cơ thể và sao chép ngược lại được sử dụng để sao chép mRNA thành ds-cDNA ổn định (màu xanh). Trong các mô hình siêu nhỏ, ds-cDNA bị phân mảnh và được gắn nhãn huỳnh quang (cam). Các mảng được gắn nhãn liên kết với một mảng các oligonucleotide bổ sung, và đo cường độ huỳnh quang trên mảng cho thấy sự phong phú của một tập hợp các chuỗi được xác định trước. Các trình tự này thường được lựa chọn để so sánh về các gen quan tâm trong hệ gen của cơ thể.
RNA-Seq.
Trong sinh vật, gen được sao chép và ghép nối (ở sinh vật nhân chuẩn) để sinh ra mRNA trưởng thành (màu đỏ). Các mRNA từ cơ thể, phân mảnh và sao chép vào ds-cDNA ổn định (màu xanh). Các ds-cDNA được sắp xếp bằng cách sử dụng các phương pháp high-throughput và short-read sequencing. Các trình tự này sau đó có thể được sắp xếp theo trình tự bộ gen tham chiếu để tái tạo lại những vùng gen nào đã được phiên mã. Dữ liệu này có thể được sử dụng để chú thích những gen biểu hiện ở đâu, mức biểu hiện tương đối của chúng và bất kỳ biến thể ghép nối thay thế nào.
Slide 15. ỨNG DỤNG CỦA PROTEOMIC
Proteomics là công cụ số một trong phân tích hệ protein của cơ thể sinh vật. Kỹ thuật proteomics đã được áp dụng cho các nghiên cứu chỉ thị sinh học của các bệnh ung thư như: ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi, ung thư thanh quản, ung thư vòm họng, ung thư gan, ung thư máu... Việc nghiên cứu bằng kỹ thuật proteomics đang ngày càng được mở rộng, đem lại kết quả ngày càng lớn ứng dụng trong sinh học, y học, dược học và nghiên cứu cơ chế của các quá trình sinh học
Phân Tích Proteomic Mô Gan Của Người Bị Ung Thư Gan Nguyên Phát
- Mục đích: tìm ra các protein đặc trưng có liên quan đến bệnh UTG
- Hệ protein nghiên cứu
Ty thể là bào quan phổ biến trong gan. Mỗi tế bào gan có hàng nghìn ty thể. Trong ung thư gan, sự rối loạn chức năng ty thể có thể có những mối liên quan trực tiếp đến bệnh.
Microsome là những túi tiết được hình thành từ mạng lưới nội chất khi các tế bào eukaryote bị phá vỡ.Microsome là một công cụ có giá trị lớn trong việc điều tra sự trao đổi chất của các hợp chất và kiểm tra các tương tác thuốc.
Slide 16. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
Có 3 giai đoạn chính
1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN
2. PHÂN TÍCH HỆ PROTEIN TY THỂ VÀ MICROSOME TÁCH TỪ MÔ GAN TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
3. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS
Slide 17,18. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN
Tiến hành tách chiết và phân tích song song protein ty thể và protein microsome của tế bào từ mô gan ung thư (mẫu bệnh) và mô gan bình thường (mẫu đối chứng).
Mẫu mô được nghiền rồi thực hiện các bước ly tâm với những tốc độ khác nhau để phân tách ty thể và microsome của tế bào từ mô gan. Sau đó tách chiết protein và điện di SDS-PAGE để kiểm tra kết quả tách chiết.
Trong điện di SDS-PAGE, mỗi protein hoặc một vài protein có cùng khối lượng phân tử được hiện lên dưới dạng từng băng vạch khác nhau. Băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lượng protein loại đó càng lớn. Số lượng băng trong một giếng điện di càng nhiều, thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú.
Trong kết quả điện di lần 1, đã thấy có sự xuất hiện của các băng vạch protein. Tuy nhiên, sự biểu hiện của các băng vạch là chưa rõ ràng, đặc biệt với các băng vạch phía trên biểu hiện các protein có khối lượng lớn. Do đó, tiến hành tủa mẫu với dung dịch acetone với tỉ lệ 1 thể tích mẫu với 5 thể tích acetone trong 60 phút ở -20oC.
Kết quả điện di kiểm tra lần 2 cho thấy các băng protein phân tách rõ ràng, với những băng trải đều từ trên xuống dưới và đặc biệt đã hạn chế được hiện tượng kéo vệt như ở bản gel điện di trước tủa.
Kết quả như trên đã cho thấy, với kỹ thuật tách ty thể và microsome, đã thu được các dịch protein phù hợp cho các bước tiếp theo của quá trình phân tích proteomics.
Slide 19. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
2. PHÂN TÍCH HỆ PROTEIN TY THỂ VÀ MICROSOME TÁCH TỪ MÔ GAN TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
Cho đến nay, điện di hai chiều (2-DE) vẫn là kỹ thuật được dùng phổ biến nhất để phân tách các protein trong một mẫu phức tạp. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0.1 đơn vị pI và 1 kDa về khối lượng phân tử. Protein trong dịch chiết mô gan bình thường và mô gan ung thư của bệnh nhân ung thư gan cùng được phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein.
Slide 20. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
2. PHÂN TÍCH HỆ PROTEIN TY THỂ VÀ MICROSOME TÁCH TỪ MÔ GAN TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
Sau khi thu được protein, tiến hành điện di hai chiều để phân tách protein trong khoảng pH 4-7. Kết quả điện di cho thấy các protein đã được phân tách thành từng điểm (spot), hiện lên rõ ràng, riêng rẽ và phân bố trải khắp bản gel
Slide 21. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
2. PHÂN TÍCH HỆ PROTEIN TY THỂ VÀ MICROSOME TÁCH TỪ MÔ GAN TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
Phần mềm Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các protein thuộc mô gan ung thư so với mô gan bình thường thông qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel điện di hai chiều. Phần mềm giúp xác định các spot tương ứng trên các bản gel và tính toán giá trị cường độ khối trung bình của các spot, đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel. Bằng phần mềm này, đã phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, và đã xác định được các spot trên mỗi bản gel.
Thống kê các spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường, nhận thấy có 43 spot khác biệt rõ ràng giữa hai bản gel, bao gồm: 1 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư, 1 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô bình thường, 21 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư, 20 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thư.
Slide 22. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
3. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS
Sau khi phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, những spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường được cắt và thủy phân, thu được hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ liệu về khối lượng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi enzyme trypsin. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại đầu C của lysine và arginine. Thông thường, một protein 10 kDa sẽ bị trypsin phân cắt thành 30 đoạn peptide có khối lượng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc điểm thuận lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh ngay cả trong dung dịch lẫn khi thủy phân trong gel. Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS đã xác định được các peptide trong mẫu thủy phân protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị. Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hoành biểu diễn khối lượng của peptide (đơn vị dalton) và trục tung biểu thị độ lớn của tín hiệu tương ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV)
Slide 23. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
3. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS
Sau khi phân tích khối phổ, protein được nhận dạng theo phương pháp PMF (Peptide mass fingerprint), khối lượng của các peptide được tạo ra sau khi thủy phân được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI, sử dụng phần mềm Mascot
Slide 24. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
Kết quả cho thấy với mẫu protein ty thể đã nhận dạng được 18 protein trong đó có 13 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết (bảng 3).
Bảng 1. Danh sách các protein được xác định bằng phân tích khối phổ từ bản gel protein ty thể tách từ mô gan ung thư so sánh với mô gan bình thường
Spot Yếu tố nhận dạng NCBI Tên protein KLPT
(Dalton) pI % phù hợp Score Biểu hiện
S5 Q5VTC4 Hexokinase 2 60.786 6.84 23 84 ↓
S26 G25909 Chain A, Crystal Structure Of The Human 70kda Heat Shock Protein 5 45.172 5.88 28 99 ↑
S54 GRP78 78 kDa glucose-regulated protein. 72.404 5.07 22 64 ↑
S60 SIRT6 NAD-dependent deacetylase sirtuin-6. 39.442 9.31 15 59 ↑
S61 MA7D2 MAP7 domain-containing protein. 82.375 8.95 11 62 ↑
S63 GGA1 ADP-ribosylation factor-binding protein GGA1. 70.630 5.18 10 63 ↑
S68 ARHGJ Rho guanine nucleotide exchange factor. 90.012 7.31 11 67 ↑
S77 ATPB ATP synthase subunit beta 56.525 5.26 23 87 ↓
S84 CH60
60 kDa heat shock protein.
61.190 5.70 29 63 ↑
S110 9606 P53 Celllular tumor antigen p53 43.710 5.63 11 57 ↓
S112 NRL Neural retina-specific leucine zipper protein 26.098 6.73 10 57 +
S113 Q8MHN7 MHC class I antigen 21.130 6.64 40 73 ↓
S217 A33370 H+ -transporting two sector ATPase beta chain precursor, mitochondrial 56.525 5.26 15 77 ↓
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm ở mô ung thư.
Slide 25. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
Kết quả với mẫu protein microsome, đã nhận dạng được 21 protein trong đó có 16 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết.
Bảng 2. Danh sách các protein được xác định bằng phân tích khối phổ từ bản gel microsome tách từ mô gan ung thư so sánh với mô gan bình thường
Spot Yếu tố nhận dạng NCBI Tên protein KLPT
(Dalton) pI % phù hợp Score Biểu hiện
S7 MVP Major vault protein (MVP) 99.135 5.34 18 74 +
S9 CABO2683 TCR BETA PRECURSOR 16.787 5.78 54 73 +
S17 NUMA1 Nuclear mitotic apparatus protein 1 239.217 5.63 12 72 +
S18 Gi119607928 mitochondrial ribosome 20.810 6.7 54 90 +
S31 ZN806 Zinc finger protein 806 69.447 6.87 21 67 ↑
S33 LACTB Serine beta-lactamase-like protein LACTB, mitochondrial 61.119 8.71 20 65 +
S40 AAF66033 Immunoglobulin heavy chain variable region 9.223 9.26 50 84 ↑
S49 AJHUQ glutamate-ammonia ligase 42.128 6.61 17 70 +
S54 Q53HF2 Heat shock 70kDa protein 8 isoform 2 variant 53.466 5.62 25 88 ↑
S56 MYT1L Myelin transcription factor 1-like protein 133.016 4.87 15 107 ↑
S104 gi55959738 nasal embryonic LHRH factor 16.372 5.59 26 60 +
S116 O78181 Minor histocompatibility antigen HA-1 2.711 5.59 95 65 +
S117 TDRD72 Tudor domain-containing protein 7 125.072 6.84 12 71 +
S130 ATCHB Beta-actin 42.058 5.29 36 85 ↑
S170 TXIP1 Translin-associated factor X-interacting protein 1 77.015 4.99 16 72 +
S184 PSD7 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 37.061 6.29 21 68 +
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; +, protein chỉ có ở mô ung thư.
Slide 26. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng hay giảm trong mô gan ung thư đều là những đặc trưng về bệnh và có thể là những protein chỉ thị ung thư. Trong nghiên cứu này, đã nhận dạng được 18 spot protein tương ứng với 13 protein đã được định danh và 5 protein giả thiết ở bản gel protein ty thể và ở bản gel protein microsome là 16 protein đã được định danh, 7 protein giả thiết trong tổng số 23 spot. Các protein đã được định danh được mô tả tóm tắt trong bảng 3 và bảng 4
Bảng 3. Tóm tắt chức năng chính của các protein ty thể đã được định danh có biểu hiện khác biệt ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường
STT Tên protein Chức năng
1 Chain A, Crystal Structure Of The Human 70 kDa Heat Shock Protein 5 Đáp ứng lại những dạng stress của tế bào
2 78 kDa glucose-regulated protein Có thể đóng một vai trò trong việc tạo điều kiện liên kết các phức hợp protein bên trong lưới nội chất đáp ứng các stress tế bào
3 NAD-dependent deacetylase sirtuin-6 Có vai trò trong việc làm ổn định nhiễm sắc thể sau phiên mã
4 MAP7 domain-containing protein Cấu trúc tế bào
5 ADP-ribosylation factor-binding protein GGA1 Vận chuyển protein trong thể Golgi
6 Rho guanine nucleotide exchange factor Yếu tố kết thúc phiên mã
7 ATP synthase subunit beta Tham gia tổng hợp ATP
8 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Đáp ứng lại những dạng stress tế bào
9 P53 Celllular tumor antigen Tham gia điều hòa phiên mã
10 Neural retina-specific
leucine zipper protein
Điều hòa phiên mã, quy định biểu hiện một số gen như RHO và PDE6B
11 MHC class I antigen Đáp ứng miễn dịch
12 H+ -transporting two sector ATPase beta chain precursor, mitochondrial Vận chuyển ion H+
13 Hexokinase 2
Enzyme phosphoryl hóa đường 6 cacbon, hexose thành hexose phosphate
Slide 27. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
Bảng 4. Tóm tắt chức năng chính của các protein microsome đã được định danh có biểu hiện khác biệt ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường
STT Tên protein Chức năng
1 Major vault protein (MVP) Tham gia kênh vận chuyển giữa nhân và tế bào chất. Có khả năng đáp ứng thuốc
2 TCR BETA PRECURSOR Thụ thể tế bào T nhận dạng kháng nguyên
3 Nuclear mitotic apparatus protein 1 Tham gia vào quá trình phân bào
4 mitochondrial ribosome protein Tổng hợp protein trong ty thể
5
Zinc finger protein 806 Có thể hoạt động như một chất kìm hãm quá trình phiên mã hay một chất hoạt hóa quá trình phiên mã, phụ thuộc vào trạng thái của tế bào.
6 Serine beta-lactamase-like protein LACTB, mitochondrial Kiểm soát hoạt động của beta-lactamase
7 Immunoglobulin heavy chain variable region Vai trò trong tiếp nhận đáp ứng miễn dịch
8 glutamate-ammonia ligase Tham gia phản ứng phân giải ATP
9 Heat shock 70kDa protein 8 isoform 2 variant Đáp ứng lại các stress tế bào
10 Myelin transcription factor 1-like protein Tham gia điều hòa quá trình phiên mã
11 Nasal embryonic LHRH factor Được cho là một protein liên kết với ARN
12 Minor histocompatibility antigen HA-1 Liên quan đến phản ứng tự miễn
13 Tudor domain-containing protein 7 Chức năng chưa rõ ràng, có thể có vai trò tương tác với các polypeptide methyl hóa arginine
14 Beta-actin Tham gia cấu trúc tế bào
15 Translin-associated factor X-interacting protein 1 Tham gia điều hòa quá trình phiên mã
16 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 Tham gia điều hòa proteasome 26S liên quan đến sự suy thoái ATP phụ thuộc vào các protein ubiquitinated
Dựa vào kết quả nhận dạng protein, thấy có nhiều loại protein biểu hiện khác nhau giữa mô gan bình thường và mô gan ung thư. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của các protein có thể là nguyên nhân dẫn đến rối loạn hoạt động tế bào đưa đến tình trạng ung thư, hoặc cũng có thể là do quá trình tăng sinh tế bào đem lại. Do đó, các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư và mô gan bình thường đều có thể trở thành protein chỉ thị cho ung thư gan. Dưới đây là sự mô tả chức năng của một số protein được nhận dạng trong nghiên cứu này có liên quan đến tình trạng ung thư.
Slide 28. QUY TRÌNH NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PROTEOMIC
KẾT LUẬN
1. Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng hay giảm trong mô gan ung thư đều là những đặc trưng về bệnh và có thể là những protein chỉ thị ung thư.
2. Các protein đã được nhận dạng trong ty thể bao gồm các protein cấu trúc tế bào, các protein tham gia vào quá trình miễn dịch bảo vệ cơ thể, quá trình trao đổi chất, phiên mã, dịch mã. Đặc biệt trong đó có các protein: HSP 70, HSP 60, ATP synthase biểu hiện tăng, và các protein p53, MHC I có biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung thư.
3. Các protein đã được nhận dạng trong bản gel microsome bao gồm các protein tham gia vào các quá trình trao đổi chất, điều hòa phiên mã, miễn dịch và protein cấu trúc tế bào. Đặc biệt là các protein: HSP 70, MVP, Zinc finger và Beta-actin đều có biểu hiện tăng ở mô ung thư.